=====定量问题=====

1、老师敲除gene，验证以敲除，转录组该gene有表达量（且有可能fpkm高于对照组）？

这种情况可以，找到老师敲除的位置，先查看igv，是否该位置reads以被敲除，如果已经敲除，则igv可以证明老师的敲除已经成功了，gene的fpkm高，则可能是该gene的其他位置存在大量的reads；如果igv显示老师敲除的位置就是存在大量reads，则可能需要重建库，如果需要定量结果，则将老师敲除位置整理成gtf格式（exon）进行定量即可。

根据老师提供的引物查找在染色体上的位置（使用与引物与gene序列没有错配的情况），可使用以下脚本：

  /TJPROJ6/RNA_SH/script_dir/genome/find_chr_location_of_primer.py -h
  usage: find_chr_location_of_primer.py [-h] [-T TRANSCRIPT] [-G GTF] [-P PRIMER] [-O OUTFILE]                                       
  
  find location on chr
  
  optional arguments:
    -h, --help            show this help message and exit
    -T TRANSCRIPT, --transcript TRANSCRIPT    the transcript fa  #参考基因组的转录本序列，在参考基因组目录中有                        
    -G GTF, --gtf GTF     the gtf file  #参考基因组的GTF文件，在参考基因组目录中有
    -P PRIMER, --primer PRIMER     the primer file ,3 column(primer_name left_primer right_primer)  #老师提供的引物信息，整理成3列，Tab分隔                     
    -O OUTFILE, --outfile OUTFILE     the out file  #输出文件
                          

2、老师关注gene在igv中存在大量reads，但是定量结果为0？

可以先使用samtools从bam中拿到比对到该位置的reads，命令如下：

  samtools view abc.bam scaffold1:30000-100000  > abc_30000_100000.sam

然后查看abc_30000_100000.sam中是否的唯一比对（hisat2比对看NH:i:1），看是否是成对比对（bam中第7列为=），查看GTF中该区域是否有存在多个gene重复位置的情况。

以上情况可以使用RSEM软件定量避免，脚本如下：
  /TJPROJ6/RNA_SH/script_dir/RSEM/RSEM/RSEM.py -h
  usage: RSEM [opthions] [value]
  
  This program is used to generate scripts for quantification by RSEM!
  
  optional arguments:
    -h, --help      show this help message and exit
    --fa            the fa of genenome #染色体fa文件
    --gtf           the gtf of genenome #GTF注释文件
    --sample        sample name #样品名
    --ss            ss :fr-unstranded:0.5,fr-firststrand:1,fr-secondstrand:0 #普转建库0.5（默认），链特建库0（1链（reverse））
    --readtype      single,paired #单端 or 双端
    --rootdir       the directory of the project #分析目录
    --cleanfq_dir   the dir of clean.fq.gz #clean目录
    --count         the count level,gene or transcript,default:transcript #转录本水平（默认）或者基因水平