====== HUMANn3流程升级 ======
===== 一、简介 =====

  HUMAnN3是一款快速获得宏基因组、宏转录组物种和功能组成的软件，采用分层式(tiered)检索策略，可以在环境和宿主相关群体中快速、准确获得种水平的功能组成，结果同时获得功能通路中具体物种组成，建立起了物种与功能的联系，可进一步研究功能组成。
  
===== 二、升级关键点 =====
==== 1. 软件及依赖项升级 ====
HUMAnN2 =>HUMAnN3

MetaPhlAn (2.6.0) => MetaPhlAn (4.0.1)

Bowtie2 (2.2.4)=> Bowtie2 (2.4.5)

Diamond (0.8.22.84) => Diamond (2.0.15.153)

==== 2. 数据库升级 ====
ChocoPhlAn （7673 => 12773）

uniref50  ( 4.6G => 12G )

misc (总量 668M => 2.9G )

MetaPhlAn数据库及bowtie2索引 (总量 1.8G => 35G )
==== 3. 分析主脚本升级 ====
humann2_pipeline.v2.1.pl ==> humann3_pipeline_v1.0.pl
===== 三、文件配置 =====
样本ID和分组信息：group.list
<code>
W.B1	W.B
W.B2	W.B
W.B3	W.B
W.J1	W.J
W.J2	W.J
W.J3	W.J
</code>
样本ID及路径信息：Dataclean.total.list
<code>
W.B1	/TJPROJ5/META_ASS/meta/yaolijie/X101SC19114085-Z02/X101SC19114085-Z02-F001/HostClean/W.B1/W.B1_350.nohost.fq1.gz,/TJPROJ5/META_ASS/meta/yaolijie/X101SC19114085-Z02/X101SC19114085-Z02-F001/HostClean/W.B1/W.B1_350.nohost.fq2.gz
W.B2	/TJPROJ5/META_ASS/meta/yaolijie/X101SC19114085-Z02/X101SC19114085-Z02-F001/HostClean/W.B2/W.B2_350.nohost.fq1.gz,/TJPROJ5/META_ASS/meta/yaolijie/X101SC19114085-Z02/X101SC19114085-Z02-F001/HostClean/W.B2/W.B2_350.nohost.fq2.gz
W.B3	/TJPROJ5/META_ASS/meta/yaolijie/X101SC19114085-Z02/X101SC19114085-Z02-F001/HostClean/W.B3/W.B3_350.nohost.fq1.gz,/TJPROJ5/META_ASS/meta/yaolijie/X101SC19114085-Z02/X101SC19114085-Z02-F001/HostClean/W.B3/W.B3_350.nohost.fq2.gz
W.J1	/TJPROJ5/META_ASS/meta/yaolijie/X101SC19114085-Z02/X101SC19114085-Z02-F001/HostClean/W.J1/W.J1_350.nohost.fq1.gz,/TJPROJ5/META_ASS/meta/yaolijie/X101SC19114085-Z02/X101SC19114085-Z02-F001/HostClean/W.J1/W.J1_350.nohost.fq2.gz
W.J2	/TJPROJ5/META_ASS/meta/yaolijie/X101SC19114085-Z02/X101SC19114085-Z02-F001/HostClean/W.J2/W.J2_350.nohost.fq1.gz,/TJPROJ5/META_ASS/meta/yaolijie/X101SC19114085-Z02/X101SC19114085-Z02-F001/HostClean/W.J2/W.J2_350.nohost.fq2.gz
W.J3	/TJPROJ5/META_ASS/meta/yaolijie/X101SC19114085-Z02/X101SC19114085-Z02-F001/HostClean/W.J3/W.J3_350.nohost.fq1.gz,/TJPROJ5/META_ASS/meta/yaolijie/X101SC19114085-Z02/X101SC19114085-Z02-F001/HostClean/W.J3/W.J3_350.nohost.fq2.gz
</code>
运行脚本
<code>
perl /TJPROJ1/META_ASS/script_Advanced_analysis/HUMANn3/bin/humann3_pipeline_v1.0.pl \
 --input /TJPROJ1/META_ASS/script_Advanced_analysis/HUMANn2/example/Dataclean.total.list \
 --outdir output \
 --pathdb kegg-metacyc \
 --step 123 \
 --func go-ko-eggnog-pfam-level4ec \
 --group /TJPROJ1/META_ASS/script_Advanced_analysis/HUMANn2/example/group.list \
 --notrun
</code>

===== 四、流程简介 =====
==== step0.merge_reads.sh ====

合并双端数据
占用资源：1G          
占用时间：30min   

==== step1.1.run_humann.sh ====

调用humann3进行分析
占用资源：50G    5线程
占用时间：65 h

脚本关键内容：
加载humann3环境，单独加载bowtie2

调用Humann3，生成genefamily文件

调用kegg-pathway数据库

调用kegg-module数据库

均一化

输出文件结果说明：https://github.com/biobakery/humann/#1-gene-families-file

临时文件：每个样本（5G）生成约120G的临时文件

==== step1.2.merge_humann.sh ====

调用humann_join_tables将所有样本的注释信息及丰度连接起来
占用资源：2G
占用时间：10 min

==== step2.1.function_abundance.sh ====

计算每个样本的5种功能丰度并均一化
占用资源：2G
占用时间：10min

==== step2.2.merge_abundance.sh ====

将每个样本的5中功能丰度连接起来，并添加功能名称注释 
占用资源：2G
占用时间：5min

==== step3.compare.sh ====

合并group.list，进行差异检验及其它统计分析，并进行可视化
占用资源：2G
占用时间：15min
脚本主要思路：
输入文件：metacyc , kegg_pathway , kegg_module, ko, go, eggnog, pfam, level4ec  7个样本相对丰度文件
输入文件：group.list
调用函数：humann_barplot
统计计算：丰度柱状图、PCA、威尔克斯非参数检验、top10 柱状图、simper、分组top10 柱状图、分组 simper、T检验

==== step4.getresult.sh ====

抓取结果
占用资源：0.5G
占用时间：10 min