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可选择性多聚腺苷酸化 (alternative polyadenylation, APA) 在基因表达调控中起着重要的作用。 位于最后一个外显子的 APA 可以产生具有不同 3'UTR 长度的 mRNA 异构体，在细胞中可影响信使 RNA (messagerRNA, mRNA) 的稳定性、 翻译效率、 转运及亚细胞定位等。有研究发现APA 与一系列关键生物现象的关系， 包括免疫应答、 神经反应、 胚胎发育和肿瘤发生等都有密切的关联。

使用软件 DaPars ：

详见Dapars 说明文档 DaPars

1. bed 文件 (可从UCSC 网站下载)

ben 文件下载链接： UCSC bed 文件下载

bed 文件格式 ： bed 文件格式

chr1	66999824	67210768	NM_032291	0	+	67000041	67208778      25	227,64,25,72,57,55,176,12,12,25,52,86,93,75,501,128,127,60,112,156,133,203,65,165,2013,	0,91705,98928,101802,105635,108668,109402,126371,133388,136853,137802,139139,142862,145536,147727,155006,156048,161292,185152,195122,199606,205193,206516,207130,208931,
chr1	33546713	33585995	NM_052998	0	+	33547850	33585783      12	182,121,212,177,174,173,135,166,163,113,215,351,	0,275,488,1065,2841,10937,12169,13435,15594,16954,36789,38931,
chr1	16767166	16786584	NM_001145278	0	+	16767256	16785385      104,101,105,82,109,178,76,1248,	0,2960,7198,7388,8421,11166,15146,18170,
chr1	16767166	16786584	NM_001145277	0	+	16767256	16785491      182,101,105,82,109,178,1248,	0,2960,7198,7388,8421,11166,18170,
chr1	8384389	8404227	NM_001080397	0	+	8384389	8404073	0	8	397,93,225,728,154,177,206,421,	0,968,1488,5879,11107,13486,15163,19417,
chr1	16767166	16786584	NM_018090	0	+	16767256	16785385      182,101,105,82,109,178,76,1248,	0,2960,7198,7388,8421,11166,15146,18170,
chr1	25071759	25170815	NM_013943	0	+	25072044	25167428      357,110,126,107,182,3552,	0,52473,68825,81741,94591,95504,
chr1	48998526	50489626	NM_032785	0	-	48999844	50489468      14	1439,27,97,163,153,112,115,90,40,217,95,125,123,192,	0,2035,6787,54149,57978,101638,120482,130297,334336,512729,712915,1164458,1318541,1490908,

2. genename 文件 (可选)

#name   name2
NM_032291       SGIP1
NM_052998       ADC
NM_001145278    NECAP2
NM_001145277    NECAP2
NM_001080397    SLC45A1
NM_018090       NECAP2
NM_013943       CLIC4
NM_032785       AGBL4
NM_001195684    TGFBR3
NM_001195683    TGFBR3
NR_036634       TGFBR3
NM_001918       DBT
NM_003243       TGFBR3
NM_030806       C1orf21
NM_022457       RFWD2
NM_001001740    RFWD2
NM_021222       PRUNE

3 使用脚本通过以上两个文件转换得到utr.bed 文件

脚本路径：

/TJPROJ1/RNA/shouhou/script_dir/other/Dapars/DaPars_Extract_Anno.py

unsge:

python /TJPROJ1/RNA/shouhou/script_dir/other/Dapars/DaPars_Extract_Anno.py -b hg19_refseq_whole_gene.bed -s hg19_4_19_2012_Refseq_id_from_UCSC.txt -o hg19_refseq_extracted_3UTR.bed

转换后的 3-utr.bed 格式

chr15   41795161        41795757        NM_002220|ITPKA|chr15|+ 0       +
chr9    95473645        95477745        NM_001003800|BICD2|chr9|-       0       -
chr19   50921099        50921275        NM_001308632|NA|chr19|+ 0       +
chr6    44201154        44201888        NM_001304466|NA|chr6|+  0       +
chr10   126446400       126449072       NM_001304467|NA|chr10|- 0       -
chr11   92623657        92629635        NM_001008781|FAT3|chr11|+       0       +
chr6    137245023       137246798       NM_001008783|SLC35D3|chr6|+     0       +
chr16   90061167        90063028        NR_003227|AFG3L1P|chr16|+       0       +
chr13   80910111        80911891        NM_001318537|NA|chr13|- 0       -
chr14   101459573       101459646       NR_003224|SNORD114-31|chr14|+   0       +
chr14   101458256       101458326       NR_003223|SNORD114-30|chr14|+   0       +
chr14   101456428       101456496       NR_003222|SNORD114-29|chr14|+   0       +
chr14   101455467       101455537       NR_003221|SNORD114-28|chr14|+   0       +
chr14   101454498       101454566       NR_003220|SNORD114-27|chr14|+   0       +
chr1    146465878       146467744       NM_001278267|NA|chr1|+  0       +
chr16   8946799 8949183 NM_001278262|NA|chr16|- 0       -
chr14   101391158       101391227       NR_003229|SNORD113-1|chr14|+    0       +
chr16   90066857        90067195        NR_003228|AFG3L1P|chr16|+       0       +

4 . bigwig 格式文件（由bam 文件转换而来）

bam to wig

genomeCoverageBed -bg -ibam CML_2.bam -g genelength -split >CML_2.wig
genomeCoverageBed -bg -ibam APP_1.bam -g genelength -split >APP_1.wig

5 . 运行第二步脚本。

准备配置文件 DaPars_test_data_configure.txt

Annotated_3UTR=utr.bed                      #第一步生成的utr.bed
Group1_Tophat_aligned_Wig=CML_2.wig         #由样品1 bam 文件转化的wig 文件
Group2_Tophat_aligned_Wig=APP_1.wig         #由样品2 bam 文件转化的wig 文件
Output_directory=DaPars_Test_data/          #输出文件路径
Output_result_file=DaPars_Test_data

#Parameters
Num_least_in_group1=1
Num_least_in_group2=1
Coverage_cutoff=30
FDR_cutoff=0.05
PDUI_cutoff=0.5
Fold_change_cutoff=0.59

第二步 脚本路径：

/TJPROJ1/RNA/shouhou/script_dir/other/Dapars/DaPars_main.py

usage :

python /TJPROJ1/RNA/shouhou/script_dir/other/Dapars/DaPars_main.py  DaPars_test_data_configure.txt

串写脚本：

python /TJPROJ6/RNA_SH/personal_dir/fengjie/SOFTWARE/APAtrap/APA_prep.py \
	--bamdir /TJPROJ6/RNA_SH/personal_dir/fengjie/Personal_analysis/APA_analysis/bam \
	--samples C1,C2,C3,T1,T2,T3,T4,M1,M2,M3 \
	--groups T,C,M \
	--s2g T1:T2:T3:T4,C1:C2:C3,M1:M2:M3 \
	--compares TvsC,MvsC,TvsM \
	-software DaPars \
	--gtf /TJPROJ13/GB_TR/reference_data/Animal/Mus_musculus/Mus_musculus_Ensemble_94/Mus_musculus_Ensemble_94.gtf \
	--outdir /TJPROJ6/RNA_SH/personal_dir/fengjie/Personal_analysis/APA_analysis/DaPars \

Gene	fit_value	Predicted_Proximal_APA	Loci	A_1_long_exp	A_1_short_exp	A_1_PDUI      B_1_long_exp	B_1_short_exp	B_1_PDUI	Group_A_Mean_PDUI	Group_B_Mean_PDUI	PDUI_Group_diff	P_val	adjusted.P_val	Pass_Filter
MGG_16866|NA|chr3|-	194.0	4583410	chr3:4583310-4583667	111.08	22.44	0.83	201.32	42.75 0.82	0.83	0.82	0.01	0.886944721141	1.0	N
MGG_01784|NA|chr2|-	145.7	4818859	chr2:4818744-4819128	64.91	0.11	1.00	39.25	7.17  0.85	1.0	0.85	0.15	0.0016820131859	0.00694232193925	N
MGG_07736|NA|chr3|+	68.1	5574813	chr3:5574612-5575100	NA	NA	NA	13.22	27.26 0.33	NA	NA	NA	NA	NA	N
MGG_04647|NA|chr2|-	1354.1	1128467	chr2:1128015-1128668	77.86	60.32	0.56	149.88	126.760.54	0.56	0.54	0.02	0.752815723012	0.955064601115	N

readme:

选择性多聚腺苷酸化（APA）是一种重要的前体RNA加工机制，广泛存在于所有真核生物中。通过在RNA 3′UTR不同位置上添加polyA尾巴，可以选择性地调节3′UTR的长短。由于3′UTR含有多种顺式调控元件，例如：miRNA或RNA结合蛋白（RBP）结合位点，因此，APA可以通过调控3′UTR的长度，影响目标mRNA的稳定性和翻译效率以及翻译后蛋白质的细胞定位，进而精细调节基因表达，对一系列细胞过程（如增殖、分化和肿瘤发生）产生根本性的影响。（引自https://www.seqchina.cn/14138.html）
为了使用RNA-seq来评价APA事件，有学者发明了DaPars算法。DaPars算法是利用远端PolyA位点使用比(Percentage of Distal polyA site Usage Index, PDUI）的数值来评价APA事件的发生比例。PDUI的数值范围是0-1，如果PDUI接近于1则代表基因存在更多的长3'UTR；如果PDUI接近于0则代表基因存在更多的短3'UTR。


Gene：基因名称和位置
fit_value：回归模型的参数
Predicted_Proximal_APA：预测近端Ploy(A)位点
Loci：转录本3'UTR的区域
sample_long_exp：远端Ploy(A)位点表达量
sample_short_exp：近端Ploy(A)位点表达量
sample_PDUI：样本的PDUI值，远端PolyA位点使用比(Percentage of Distal polyA site Usage Index, PDUI），在[0,1]，越接近1，3'UTR越长
DUI_Group_diff: 两个比较组合的差值
P_val：显著性检验P值
adjusted.P_val：矫正后的P值
Pass_Filter：是否差异显著
我们分析过程中使用的参数如下：
FDR_cutoff=0.05
PDUI_cutoff=0.5
Fold_change_cutoff=0.59

可变PloyA 文献

cfim25_links_alternative_polyadenylation_to_glioblastoma_tumor_suppression.pdf