MetaCHIP，结合序列比对和系统发育分析，可以实现无参考基因组的、在菌群层次上横向转移基因（HGT，horizontal gene transfer）的检测。

横向转移基因（HGT）是指有机体之间遗传物质的转移，通常是微生物进化和适应性的重要原因（例如抗性基因，毒力基因）。前人分析转移基因的方法基本分为3种，以1.基因组成分特征（compositional features）为主的方法（如GIST，IslandViewer）；2.最佳比对（best-match）为主的方法（如DrakHorse，HGTector）；3. 显性系统发育分析为主的方法（如Ranger-DTL，AnGST），即对比gene tree和species tree之间的不一致性从而找到转移的gene。以往方法一是不适用于细菌群落，二是需要reference genome，这都限制了它的运用，MetaCHIP就是能解决以上两点问题。

• best-match

1. 将整个基因组数据中的ORF预测出来
2. 将ORFs两两用BLASTN比对，经过参数筛选后，得到两两的matches。
3. 将所有genomes分成group（按照分类学注释分组，例如A，B，C，这里的group可以是class/order/genus层面），各组的一条genome分别叫Ax，By，Cz; 每条genome上的一个gene叫Ax-N，By-N，Cz-N; 假设A组中有个gene叫A1-01，它的BLASTN结果在每组match为IAx，IBy，ICz。它与每组match的平均identity为IAA（不算自己），IAB，IAC。
4. 如果IAA不是所有结果中最大的，并且IAA不等于0（即除了自己在本组都没相似的gene，此时这个gene就可能是黑户混进来的），那么除了A之外的组就是这个gene为HGT的putative candidate group。然后这组（group）中BLASTN identity最高的gene就是putative HGT candidate。
5. 计算gene A1-01这组gene和HGT putative candidate group中gene的所有identities，利用百分数确定一个cutoff（例如我们把前10%分位数对应的identity确定为cutoff），当gene A1-01与putative HGT的identity > cutoff, 这个HGT才确定下来。

• best-match

1. 通过best-match确定下来的gene pair，将这两个gene来自的两个groups中的所有orthologs拿出来建一棵gen/protein tree
2. 因为16S在genome bins时常常缺失，因此对于所有的genomes，先用CheckM识别出的43个通用的单拷贝gene（SCGs），，每个gene用HMMER进行多序列比对（MSA）后，串联构建所有genomes的species tree。然后，从这棵树中抽取只和HGT有关genes所在的genomes的subtree。
3. Ranger-DTL计算gene/protein tree与species subtree的一致性，从而判断是否发生HGT，并确定gene flow direction。

提示：软件需要用到一些第三方软件(prodigal/hmmsearch/hmmfetch/hmmalign/hmmstat/mafft/blastp/blastn/makeblastdb/fasttree)，这些软件如何在路径下失效，修改该配置文件中的对应绝对路径即可：

/TJPROJ1/META_ASS/soft/MetaCHIP/lib/python3.10/site-packages/MetaCHIP/MetaCHIP_config.py

MetaCHIP在分析前需要使用PI模块进行输入数据整理，然后使用BI模块去运行鉴定HGT

            ...::: MetaCHIP v1.10.13 :::...
        
    Core modules:
       PI            ->  Prepare input files 
       BP            ->  Run Best-match and Phylogenetic approaches
       
    Supplementary modules:
       filter_HGT    ->  Get HGTs been found at no less than n taxonomic ranks
       update_hmms   ->  Update hmm profiles used for inferring SCG tree
       get_SCG_tree  ->  Get SCG protein tree
       rename_seqs   ->  Rename sequences in a file

    # for command specific help info
    MetaCHIP PI -h
    MetaCHIP BP -h

检测classes层级的HGT

source /TJPROJ1/META_ASS/soft/anaconda3/bin/activate /TJPROJ1/META_ASS/soft/MetaCHIP
MetaCHIP PI -p NorthSea -r c -t 6 -i input_file_examples/human_gut_bins -x fasta -taxon input_file_examples/human_gut_bins_GTDB.tsv
MetaCHIP BP -p NorthSea -r c -t 6

检测多层级的HGT among phyla, classes, orders, families and genera

MetaCHIP PI -p NorthSea -r pcofg -t 6 -o Total_level_result -i input_file_examples/human_gut_bins -x fasta -taxon input_file_examples/human_gut_bins_GTDB.tsv
MetaCHIP BP -p NorthSea -r pcofg -t 6 -o Total_level_result -pfr

#检测组水平间的HGT

MetaCHIP PI -p NorthSea -g customized_grouping.txt -t 6 -i NS_37bins -x fasta
MetaCHIP BP -p NorthSea -g customized_grouping.txt -t 6

• 普通列表项目其中-i中输入的是bins所在的路径，可以基于MetaWRAP软件进行分析生成，-taxon 是GTDB-tk软件对bins的注释文件结果

- 包含所有已识别的HGT的制表符分隔文本文件。文件名格式：[prefix]_[taxon_ranks]_detected_HGTs.txt

- 已识别的供体和受体基因的核苷酸和氨基酸序列。 - 已识别的HGT的側翼区域。前链上编码的基因以浅蓝色显示，后链上编码的基因以浅绿色显示。预测为HGT的基因名称以蓝色突出显示，大字体在括号中给出成对的相同性。Contig名称在序列轨道的左下角提供，contig名称之后的数字是指受HGT约束的基因与contig的左端或右端之间的距离。根据BLASTN结果，红色条显示了contigs之间匹配区域的相似性。 - 群体之间的基因流动。带子连接捐赠者和接受者，带子的宽度与HGT的数量和与捐赠者对应的颜色相关。

- contig End_match的示例 - 全长contig匹配的示例

• 官网
• 文献链接
• 测试路径：/TJPROJ1/META_ASS/soft/MetaCHIP/test
• 测试脚本：/TJPROJ1/META_ASS/soft/MetaCHIP/test/w.sh

ps：文献关于该软件使用部分的描述：

• Putative horizontal gene transfer identification

To identify potential HGT events in algal-bacterial symbiotic systems, MetaCHIP (version 1.9.0) was employed to analyze all MAGs (Song et al., 2019; Wang et al., 2022). The metagenomic data, along with the taxonomic information of MAGs at specified ranks (e.g., phyla, genus, species), were organized using the GTDB-Tk tool, which is based on phylogenetic databases. The identification of candidate HGT events was based on the most accurate matching method. An algorithm utilizing the DeBruijn graph was applied to exclude candidates with high similarity (>95 %). For further validation, BLASTN analysis was conducted on the flanking regions. To confirm the initial predictions, each gene pair suspected of HGT was analyzed to construct a protein tree using FastTree version 2.1.10. A species tree was also generated for comparison with the gene tree. High-confidence predictions were identified, allowing us to determine the direction of gene transfer. The process concluded with the removal of redundant HGT detections to finalize the results.